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變性梯度凝膠電泳(DGGE)和溫度梯度凝膠電泳(TGGE)
發布日期:2017-02-28

福彩3d开机号和试机号彩宝网(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)最初是 Lerman 等人于20 世紀80 年代初期發明的,起初主要用來檢測 DNA 片段中的點突變。Muyzer 等人在 1993 年首次將其應用于微生物群落結構研究。后來又發展出其衍生技術,溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)。此后十年間,該技術被廣泛用于微生物分子生態學研究的各個領域,目前已經發展成為研究微生物群落結構的主要分子生物學方法之一。

 

DGGE原理:

雙鏈 DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時,其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長度的DNA 片段能夠被區分開,但同樣長度的 DNA 片段在膠中的遷移行為一樣,因此不能被區分。DGGE/TGGE技術在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎上,加入了變性劑(尿素和甲酰胺)梯度或是溫度梯度,從而能夠把同樣長度但序列不同的 DNA 片段區分開來。一個特定的 DNA 片段有其特有的序列組成,其序列組成決定了其解鏈區域(melting domain, MD)和解鏈行為(melting behavior) 。一個幾百個堿基對的 DNA 片段一般有幾個解鏈區域,每個解鏈區域有一段連續的堿基對組成。當溫度逐漸升高(或是變性劑濃度逐漸增加)達到其最低的解鏈區域溫度時,該區域這一段連續的堿基對發生解鏈。當溫度再升高依次達到各其他解鏈區域溫度時,這些區域也依次發生解鏈。直到溫度達到最高的解鏈區域溫度后,最高的解鏈區域也發生解鏈,從而雙鏈 DNA 完全解鏈。不同的雙鏈 DNA 片段因為其序列組成不一樣,所以其解鏈區域及各解鏈區域的解鏈溫度也是不一樣的。當它們進行 DGGE/TGGE 時,一開始溫度(或變性劑濃度)比較小,不能使雙鏈 DNA 片段最低的解鏈區域解鏈,此時DNA 片段的遷移行為和在一般的聚丙烯酰胺凝膠中一樣。然而一旦 DNA 片段遷移到一特定位置,其溫度(或變性劑濃度)剛好能使雙鏈 DNA 片段最低的解鏈區域解鏈時,雙鏈 DNA 片段最低的解鏈區域立即發生解鏈。部分解鏈的 DNA 片段在膠中的遷移速率會急劇降低。因此,同樣長度但序列不同的 DNA 片段會在膠中不同位置處達到各自最低解鏈區域的解鏈溫度,因此它們會在膠中的不同位置處發生部分解鏈導致遷移速率大大下降,從而在膠中被區分開來。然而,一旦溫度(或變性劑濃度)達到 DNA 片段最高的解鏈區域溫度時,DNA 片段會完全解鏈,成為單鏈 DNA分子,此時它們又能在膠中繼續遷移。因此如果不同 DNA 片段的序列差異發生在最高的解鏈區域時,這些片段就不能被區分開來。在 DNA 片段的一端加入一段富含 GC 的 DNA 片段(GC 夾子,一般 30-50個堿基對)可以解決這個問題。含有GC夾子的 DNA 片段最高的解鏈區域在 GC 夾子這一段序列處,它的解鏈溫度很高,可以防止 DNA 片段在DGGE/TGGE 膠中完全解鏈。當加了 GC 夾子后,DNA 片段中基本上每個堿基處的序列差異都能被區分開。當用DGGE/TGGE 技術來研究微生物群落結構時,要結合PCR(polymerase chain reaction)擴增技術,用 PCR 擴增的 16S rRNA 產物來反映微生物群落結構組成。通常根據16S rRNA 基因中比較保守的堿基序列設計通用引物,其中一個引物的 5’-端含有一段 GC 夾子,用來擴增微生物群落基因組總 DNA,擴增產物用于DGGE/TGGE 分析。DGGE/TGGE 有兩種電泳形式:垂直電泳和水平電泳。前者是指變性劑梯度或溫度梯度的方向和電泳方向垂直;后者是指兩個方向是平行的。在分析微生物群落的 PCR 擴增產物時,一般先要用垂直電泳來確定一個大概的變性劑范圍或溫度范圍。垂直電泳時,膠從左到右是變性劑梯度或溫度梯度。在膠的左邊,變性劑濃度或溫度低,DNA 片段是雙鏈形式,因此沿著電泳方向一直遷移。在膠的另一邊,由于變性劑濃度或溫度高,DNA 一進入膠立刻就發生部分解鏈,因此遷移很慢。在膠的中間,DNA 片段有不同程度的解鏈。在變性劑濃度或溫度臨界于DNA 片段最低的解鏈區域時,DNA 的遷移速率有急劇的變化。因此,DNA 片段在垂直膠中染色后呈 S 形的曲線,根據垂直電泳確定的范圍,再用水平電泳來對比分析不同的樣品。在用水平電泳分析樣品之前,先要優化確定電泳所需時間。一般采用時間間歇(timetravel)的方法,即每隔一定時間加一次樣品,從而使樣品的電泳時間有一個梯度,根據這個結果,確定最佳的電泳時間。通過各種染色方法可以看到DGGE/TGGE 膠中的 DNA 條帶。最常用的幾種染色方法是溴化乙啶(ethidium bromide, EB),SYBR GreenI, SYBR Gold 和銀染法。EB 法染色的靈敏度最低。SYBR Green I 和 SYBR Gold 相比 EB,能更好地消除染色背景,因此它們的檢測靈敏度比 EB 法高很多。EB 和 SYBR 染色時,雙鏈 DNA 能很好地顯色,單鏈 DNA 基本上不能顯色。銀染法的靈敏度最高,它不但能染雙鏈 DNA,也能染單鏈 DNA,但它的缺點是不能用于隨后的雜交分析。

 

PCR-DGGE/TGGE 在微生物生態學中的應用:

PCR-DGGE/TGGE 技術在微生物生態學中的一個主要用途是分析微生物群落結構組成Muyzer 等人于1993 年首次將該技術用于研究微生物菌苔和生物膜系統的群落多樣性(50)。此后,該技術被廣泛應用于各微生物生態系統,包括土壤 ,活性污泥,人體和動物腸道,溫泉,植物根系,海洋,淡水湖,油藏等。絕大部分研究都是通過擴增細菌或古細菌的 16S rRNA 基因來研究各生態系統中的細菌或古細菌群落多樣性。也有用真菌的通用引物擴增 18S rRNA 基因 ,從而研究真菌的群落多樣性。除了通過核糖體RNA 基因來分析微生物群落結構外,還可以通過擴增功能基因來研究功能基因及功能菌群的多樣性。氨單加氧酶(ammonia monooxygenase gene,amoA)基因被用來研究氨氧化菌群;[NiFe]氫化酶基因被用來研究硫酸鹽還原菌群; 多組分苯酚羥化酶大亞基基因( the largest subunit of the multi-component phenolhydroxylase,LmPH)被用來研究降酚菌群。PCR-DGGE/TGGE 技術的另一大優點是能快速同時對比分析大量的樣品。因此它既可以對比分析不同的微生物群落之間的差異,也可以研究同一個微生物群落隨時間和外部環境壓力的變化過程。除了上述兩個主要用途外,PCR-DGGE/TGGE 技術還有很多其他用途。它可以跟蹤監測細菌的富集和分離,從而評價不同培養基及培養條件對分離菌種的影響;可以檢測單個純菌 rRNA基因的微異質性;可以用來比較不同的 DNA 提取方法;另外,它還可以輔佐篩選克隆文庫以及檢測 PCR和克隆過程中的偏差。我們實驗室用 PCR-TGGE 技術研究了多個微生物生態系統的微生物群落,包括處理工業焦化廢水的活性污泥系統,人體腸道,動物腸道(豬,熊貓,昆蟲),人體口腔,纖維素降解土壤,油藏系統等。另外,我們還研究了處理工業焦化廢水的活性污泥系統中苯酚降解菌群和氨氧化菌群的功能基因多樣性。

 

DGGE/TGGE 技術的缺陷及優化:

在用分子生物學方法分析微生物群落結構組成時,有很多偏差。不同細菌的基因組大小和核糖體 RNA拷貝數不同;提取基因組總DNA 時細胞的裂解效率不同;DNA 提取和純化時有偏差;PCR 擴增過程中有偏差。除了這些,在應用DGGE/TGGE 技術分析微生物群落結構組成時還有很多其他的缺陷。DGGE/TGGE 一般只能分析 500 個堿基對以下的 DNA 片段,因此得到的系統進化相關的信息就很少。在研究復雜環境生態系統(如土壤,人體腸道)時,其中微生物種類很多。但DGGE/TGGE 圖譜中一般只有一二十個條帶,這些條帶反映的是群落中的優勢菌群。一般只有在總的微生物群落中占 1%以上的種群才能被檢測出來,系統中的弱勢菌群不能被檢測到。為了降低分析群落多樣性時的復雜度,一種方法是先根據 GC 含量的不同,將基因組總 DNA 分成各個部分,再分別 PCR-DGGE/TGGE 分析。另一個方法是使用類群特異性(group-specific)引物對基因組總 DNA 進行 PCR 擴增,再用于DGGE/TGGE 分析。在設計 PCR 引物去擴增某些特定菌群時,由于某些菌群的序列相互之間同源性不是很高,因此需要設計簡并性引物。此時,相同的微生物會有 2 個條帶,這會對微生物群落結構組成造成高估。另外,同一個細菌也可以有多個核糖體 RNA 操縱單元,它們的序列可以有微小差異,這也會高估微生物群落多樣性。DGGE的電泳條件不一樣,即使相同的樣品所得的圖譜也會有差異。在應用DGGE 時,如果所用電壓太低,需要的電泳時間就很長,變性劑梯度會有變化,因此導致圖譜也會有變動。另外,DGGE/TGGE 的一個很大的優點是可以對膠中所感興趣的條帶進行研究,得到它們的序列,從而可以直接獲得和系統生態功能相關的微生物種群的系統進化信息。以前研究DGGE/TGGE 膠中單一條帶序列組成的一個比較普遍的方法是先構建整個微生物群落的16S rRNA 克隆文庫,然后再對文庫中的克隆進行擴增,通過DGGE/TGGE 和原始樣品的條帶進行對比,能遷移到相同位置處的克隆的序列就是原始條帶所含的序列。然而,已有研究表明,不同的 DNA 條帶在DGGE/TGGE 膠中可以遷移到相同的位置,因此單一DGGE/TGGE 條帶可能含有不止一種序列。這種情形在分析復雜環境樣品時會更多。另一個研究DGGE/TGGE 膠中單一條帶序列組成的方法是直接從膠中回收DNA,然后構建其克隆文庫,再對其中的克隆進行測序。現在越來越多的研究人員采用后一種方法。然而,PCR 過程中產生的異源雙鏈(heteroduplex)和單鏈 DNA(single-stranded DNA)也會對分析單一條帶序列造成偏差。人們已經普遍意識到異源雙鏈 DNA 會在DGGE/TGGE 膠中產生虛假條帶,然而對單鏈 DNA造成的偏差還沒有引起足夠的重視。我們實驗室以某處理工業焦化廢水的活性污泥為研究對象,詳細地分析了單鏈 DNA 在分析TGGE 膠中單一條帶序列組成時所造成的影響,發現它會大大高估單一條帶中的序列多樣性。另外,我們還對比了 3 種去除單鏈DNA 的方法,發現變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(denatured polyacrylamide gel electrophoresis, d-PAGE)純化的效果最好。我們建議在進行DGGE/TGGE 電泳之前,尤其是要分析單一條帶序列時,要先用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對PCR 產物進行純化,然后再走電泳。

 

變性梯度凝膠電泳DGGE 操作步驟:

1、將海綿墊固定在制膠架上,把類似‘三明治’結構的制膠板系統垂直放在海綿上方,用分布在制膠架兩側的偏心輪固定好制膠板系統,注意一定是短玻璃的一面正對著自己。

2、共有三根聚乙烯細管,其中兩根較長的為 15.5cm,短的那根長 9cm。將短的那根與Y 形管相連,兩根

長的則與小套管相連,并連在 30ml 的注射器上。

3、在兩個注射器上分別標記‘高濃度’與‘低濃度’,并安裝上相關的配件,調整梯度傳送系統的刻度到適當的位置。

4、反時針方向旋轉凸輪到起始位置。為設置理想的傳送體積,旋松體積調整旋紐。將體積設置顯示裝置固定在注射器上并調整到目標體積設置,旋緊體積調整旋紐。例如16*16cm gels(1mm thick):設體積調整裝置到 14.5。

5、配制兩種變性濃度的丙烯酰胺溶液到兩個離心管中。

6、每管加入 18 μl TEMED,80 μl 10%APS,迅速蓋上并旋緊帽后上下顛倒數次混勻。用連有聚乙烯管標有‘高濃度’的注射器吸取所有高濃度的膠,對于低濃度的膠操作同上。

7、通過推動注射器推動桿小心趕走氣泡并輕柔地晃動注射器,推動溶液到聚丙烯管的末端。注意不要將膠液推出管外,因為這樣會造成溶液的損失,導致最后凝膠體積不夠。

8、分別將高濃度、低濃度注射器放在梯度傳送系統的正確一側固定好,注意這里一定要把位置放正確! 再將注射器的聚丙烯管同Y 形管相連。

9、輕柔并穩定地旋轉凸輪來傳送溶液,在這個步驟中最關鍵的是要保持恒定勻速且緩慢地推動凸輪,以使溶液恒速的被灌入到三明治式的凝膠板中。

10、小心插入梳子,讓凝膠聚合大約一個小時。并把電泳控制裝置打開,預熱電泳緩沖液到60℃。

11、迅速清洗用完的設備。

12、聚合完畢后拔走梳子,將膠放入到電泳槽內,清洗點樣孔,蓋上溫度控制裝置使溫度上升到 60℃。

13、用注射針點樣(預先準備好的活性污泥 16S rDNA V3 區 PCR 擴增產物,變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化)。

14、電泳(200V,5h)。

15、電泳完畢后,先撥開一塊玻璃板,然后將膠放入盤中。用去離子水沖洗,使膠和玻璃板脫離。

16、倒掉去離子水,加入 250 ml 固定液(10% 乙醇, 0.5% 冰醋酸)中,放置 15min。

17、倒掉固定液,用去離子水沖洗兩次,倒掉后加入 250 ml 銀染液(0.2% AgNO3,用之前加入 200μl 甲醛)中,放置在搖床上搖蕩,染色 15min。

18、倒掉銀染液,用去離子水沖洗兩次,倒掉后加入 250 ml 顯色液(1.5% NaOH, 0.5% 甲醛)顯色。

19、待條帶出現后拍照。

 

溫度梯度凝膠電泳TGGE 操作步驟:

1、去離子水仔細洗滌制膠所用玻璃板,用紙巾擦干。再用酒精棉球擦一遍,用紙巾擦干。將支持膜夾在兩塊玻璃板之間,用夾子夾住,放置在桌上。

2、配膠 (每塊膠配 5ml) 丙烯酰胺/雙丙烯酰胺儲存溶液(40%,37.5: 1):丙烯酰胺: 38.96g,雙丙烯酰胺:1.03g 溶于 100 ml去離子水。

3、將玻璃板傾斜放置,用 1ml 的移液器將上面配置的膠慢慢灌入兩玻璃板之間。將玻璃板水平放置半小

時以上,使膠凝固。

4、待膠凝固后,先用手撥去沒有點樣孔的玻璃板。用去離子水將支持膜背面沖洗干凈,用紙擦干。再揭開

支持膜。

5、用 1ml 移液器在 TGGE 的溫度面板(thermoblock)上加 800 μl 0.1% Triton。

6、用手抓住支持膜的兩邊,先將膜中部放于加熱面板上,再慢慢將膜鋪展開,在膜和加熱面板間盡量不要

形成氣泡。溫度梯度方向和電泳方向一致。

7、將預先準備好的樣品加入上樣孔中,每孔最多加 3 μl 樣品。

8、在膠的兩端蓋上 Waterman 濾紙(buffer wick),濾紙的另一端浸入電泳緩沖液中。

9、蓋上蓋子,預電泳(200V,7min)。

10、預電泳快結束時(6min 50sec),暫停反應。打開蓋子,揭開濾紙。在凝膠中間慢慢蓋上一層塑料膜(coverfilm)。再將濾紙蓋在膠上,然后用一塊玻璃板(coverplate with sealings)壓在濾紙上。

11、蓋上蓋子,繼續電泳(200V,3h)。

12、電泳結束后,終止程序。將支持膜取出,先用去離子水沖洗一次。

13、將膜轉移至固定液(10% 乙醇, 0.5% 冰醋酸)中,放置 5min。

14、將膜轉移至去離子水中沖洗一次,再轉移至銀染液(0.2% AgNO3,用之前加入 40μl 甲醛)中,放置在搖床上搖蕩,染色 10min。

15、將膜在去離子水中沖洗 2 次,轉移至顯色液(1.5% NaOH, 0.5% 甲醛)中。

16、待條帶出現后,將膜用去離子水沖洗 3 次,拍照。

 

注意事項:

1、配置試劑時一定要用去離子水,制膠洗膜時用的各個容器也要用去離子水洗滌干凈,以防止氯離子污染。

2、制膠是實驗的關鍵。在往玻璃板中灌膠時,要勻速地轉動滑輪,將凝膠液勻速地灌入玻璃板。

3、灌完膠后,立刻清洗注射器,以防丙烯酰胺凝固,堵塞管子。

4、DGGE 的電泳緩沖液要超過“RUN”刻度線,不要超過“Maximam”刻度線。

5、點樣時,要用小型注射器,伸入點樣孔底部點樣。

6、銀染的整個過程中,一定要戴手套。以避免手接觸膠而帶來的污染。

7、每次用完儀器后要及時清理,清洗玻璃板培養皿等玻璃儀器。

 

其它:

1、配置試劑時一定要用去離子水,制膠洗膜時用的各個容器也要用去離子水洗滌干凈,以防止氯離子污染。

2、?;げ悖╬rotection foil)用來?;の露讓姘澹╣radient block),要防止試劑浸入,每次用完后要把殘余的試劑吸干。一旦破損,應停止使用,更換后再繼續使用。

3、TGGE mini system T1T2 之間的溫度差不能超過 45℃。

4、支持膜和溫度面板間一定要加 0.1% Triton,從而確保能形成穩定的溫度梯度。

5、在鋪支持膜于溫度面板上時,要盡量避免氣泡,否則會導致溫度梯度不穩定。

6、如果要中途暫?;蛑卸系纈?一定要在打開蓋子前先關掉電源。

7、電泳過程中,不要觸摸電極線和電泳緩沖液(高壓!)。

8、從膠放到 gradient block 上到點樣完畢要盡量快速,最好不要超過五分鐘。

9、銀染的整個過程中,一定要戴手套。以避免手接觸膠而帶來的污染。

10、每次用完儀器后要及時清理,清洗玻璃板培養皿等玻璃儀器。

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